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解析—PCR實驗室設計要點

    PCR擴增檢驗實驗室設計原則上分為四個單獨的工作區域:試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區、擴增產物分析區。為避免交叉

污染,進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行,即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增產物分析區。


    各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

    實驗室空調通風系統設計及壓力控制

    PCR實驗室設計并沒有嚴格的凈化要求,但是為避免各個實驗區域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時,要嚴格控制送、排風的比

例以保證各實驗區的壓力要求。


    PCR試劑貯存和準備區該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區,不

得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制,本區并沒有嚴格的要求。


    PCR標本制備區

    該區域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。

    本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為正壓,以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外,由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染,所以應

避免在本區內不必要的走動。


    擴增反應混合物配制和擴增區

    該區域主要進行的操作為DNA擴增。此外,已制備的DNA模板 (來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在

本區內進行。本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內的不必要的走動。

個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。


    擴增產物分析區

    該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。

    本區是最主要的擴增產物污染來源,因此對本區的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。

    污染的預防與控制 PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中,常見的有以下幾種污染類型:擴增產物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑

的污染以及標本間的污染。由于一旦發生污染,實驗就必須停止,直到找到污染源為止,而且實驗結果必須作廢,需重新進行實驗。所以發生污染后再圍繞實

驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣,浪費人物力。因此要避免污染,首先應是預防,而不是排除。


    實驗室設計

    工作區域的嚴格劃分

    (1)各個實驗區域設置合理;

    (2)各個實驗區域要有明顯的標記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等),以避免各個不同實驗區域設備物品、試劑等發生混淆。

    合理的系統設置

    (1)合理的空調通風系統設置,盡量采用全送全排的空調系統;

    (2)嚴格的氣流壓力控制,保證不同的實驗區內不同的壓力要求。

    規范的操作

    (1)擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓,經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作;

    (2)在實驗操作過程中,操作者必須戴手套,并經常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施;

    (3)清潔工作及時、正確。實驗工作結束后,必須立即對本區進行清潔。除常規的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外,對一些實驗設備

還應進行高壓消毒處理。


    嚴格的管理

    (1)嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室,有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區的門;

    (2)盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

    (3)擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源,廢液不能在實驗室中傾倒,必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉,用過的吸頭等一次性材

料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理,如焚燒等;


    (4)擴增產物分析區可能會用到某些可致基因突變和有毒物質,應特別注意實驗人員的安全防護。

    完備的實驗室配套設施

    完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件,應根據各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器,如超凈工作臺、離心機、加樣器等。
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